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一种水解紫菜的酶制剂及其制备方法与流程

来源: 浏览: 16次  更新时间:2021-12-12 19:22

一种水解紫菜的酶制剂及其制备办法与过程

本创造波及制备酶制剂本领范围简直波及一种水解紫菜的酶制剂及其制备办法。



背景本领:

紫菜富含膳食纤维与多种微量元素而且还含藻类私有的藻胆蛋白,具备很高的养分价格。姑且网站登录而且还含藻类私有的藻胆蛋白,具备很高的养分价格。姑且时势部本质较好的头水、二水紫菜都被加工成海苔海苔饼搞海苔面包等一系列以紫菜为本料的产品而结余本质较差的紫菜因为口感与光彩上懊悔脚紫菜产品的品质尺度常常被直接抛弃大概者动作饲料用于水产养殖动物。然而这类紫菜本猜中常常含有更高含量的紫菜多糖。

紫菜多糖主假如存留于细胞壁中具备粘性高、分子量大、融化性差的特性。为获得紫菜多糖普遍是经过酶解的本领闭于紫菜进行水解使多糖溶出。酶制剂动作一种高效的生物催化剂姑且常用于多糖水解的酶有纤维素酶、果胶酶、糖化酶和淀粉酶等。然而因为这些酶只能博一的切割某一糖苷键其闭于紫菜破壁与多糖水解的效率有限。迄今为止保持不高效水解紫菜多糖的食物级贸易化酶制剂这也极大节制了紫菜多糖的开拓与高效力用。

姑且动物构造中酶制剂的提取与制备办法普遍为水提、浓缩、冻搞等工艺产品的纯度矮、生机差。酶制剂的进一步纯化则须要多级的柱层析分别本领实行制备过程中须要闭于样品进行透析脱盐、置换缓冲体系闭于每一步的层析柱进行洗脱、荡涤与复活工艺烦琐耗时长不适于产业化的连接消费。



本领实行因素:

本创造旨在起码在必定程度上处理相闭本领中的本领问题之一。为此本创造的手段在于供给一种水解紫菜的酶制剂及其制备办法。该办法肤浅能耗矮网站推广能耗矮闭于情况传染小可制备出酶活性高、可高效水解紫菜的酶制剂以使紫菜赢得高效力用。

为此依据本创造的实行例本创造提出了一种水解紫菜的酶制剂的制备办法其包括以下办法:

(1)将鲍鱼内脏荡涤干洁经绞肉机绞成浆状赢得鲍鱼内脏浆;

(2)将所述鲍鱼内脏浆与20mmtris-hcl缓冲液混共后置于构造捣碎机中匀浆离心过滤收集滤液;在所述滤液中介入活性炭褪色混共均匀后再次离心取上清;

(3)将所述上清上样于串联离子调换树脂顺序用20mmtris-hcl缓冲液、20mmhac-nac缓冲液和蒸馏水洗脱收集蒸馏水洗脱所得组分;

(4)将所述蒸馏水洗脱所得组分上样于超滤膜进行超滤浓缩至固形物浓度为10%得浓缩液浓缩液再冷冻搞燥得酶制剂。

依据本创造实行例的水解紫菜的酶制剂的制备办法该办法采用缓冲液提取、活性炭褪色、串联离子调换色谱和超滤浓缩的办法制备紫菜高效水解酶制剂;个中经过柱层析办法制备酶制剂能灵验去除杂质与生物构造本料戴有的不良气息这为产品在食物范围中的运用供给了保护;采用了串联离子调换色谱分别本领冲破了顽固调换色谱分别纯化过程中不共树脂间样品须要透析脱盐、置换缓冲体系处置的问题实行了一步式的高效纯化酶制剂;经串联离子调换色谱收集赢得的酶液中不含盐经浓缩、冻搞后酶制剂有纯度高、生机高的特性;而且该酶制剂具有复合酶体系能高效的水解紫菜。

个中鲍鱼内脏不妨是怪僻鲍鱼内脏大概冻存的鲍鱼内脏。鲍鱼内脏不妨包括皱褶盘鲍、杂色鲍、九孔鲍等福建常睹鲍鱼的内脏。

其他依据本创造上述实行例提出的水解紫菜的酶制剂的制备办法还不妨具犹如下附加的本领特性:

可选地办法(2)中活性炭介入量为2.0%-2.5%。

可选地办法(2)中活性炭褪色处置温度为10℃-60℃。

可选地办法(2)中活性炭处置时间为0.2h-2.0h。

进一局面办法(2)中活性炭处置时间为1.5h。

可选地办法(3)中tris-hcl缓冲液的ph为7.0-9.0洗脱体积为10-30个柱体积;

任选地hac-nac缓冲液的ph为4.0-6.0洗脱体积为10-30个柱体积;

任选地蒸馏水的洗脱体积为5-20个柱体积。

进一局面办法(3)中tris-hcl缓冲液的ph为8.0洗脱体积为20个柱体积;

任选地hac-nac缓冲液的ph为5.5洗脱体积为20个柱体积;

任选地蒸馏水的洗脱体积为15个柱体积。

可选地办法(3)中串联离子调换树脂为阴离子调换树脂和阳离子调换树脂串联。

可选地办法(3)洗脱后的串联离子调换树脂顺序用2mnacl-蒸馏水20mmtris-hcl缓冲液进行复活处置。

依据本创造的实行例本创造还提出了一种水解紫菜的酶制剂采用上述的制备办法制得。

依据本创造的实行例采用上述的办法制得酶制剂办法肤浅能耗矮闭于情况传染小可制备出酶活性高具有复合酶体系能高效的水解紫菜以使紫菜赢得高效力用。

本创造的附加方面和便宜将鄙人面的刻画中局部给出局部将从底下的刻画中变得明显大概经过本创造的试验领会到。

附图证明

图1为实行例1的活性炭增添量闭于水解紫菜的酶制剂的比生机效率;

图2为实行例2的洗脱柱体积闭于水解紫菜的酶制剂的比生机效率;

图3为实行例3的紫菜水解酶制剂与市售纤维素酶酶解紫菜的效力闭于比;

图4为实行例4的紫菜水解酶制剂与市售纤维素酶酶解紫菜的形态变革。

简直实行办法

以下经过特定的简直实例证明本创造的本领筹备。应领会本创造提到的一个大概多个办法办法并不排斥在所述拉拢办法前后还存留其他办法办法大概在这些精确提到的办法之间还不妨插入其他办法办法;还应领会这些实行例仅用于证明本创造而不必于节制本创造的范畴。而且除非另有证明各办法办法的编号仅为辩别各办法办法的方便东西而非为节制各办法办法的陈设步骤大概规定本创造可实行的范畴其相闭于闭系的变化大概安排网站推广其相闭于闭系的变化大概安排在无本质变换本领实质的情景下当亦视为本创造可实行的范畴。

为了更好的领会上述本领筹备底下更留神地刻画本创造的示例性实行例。虽然表露了本创造的示例性实行例然而该当领会不妨以百般办法实行本创造而不应被此地论述的实行例所节制。差异供给这些实行例是为了不妨更深刻地领会本创造而且不妨将本创造的范畴完备的转达给本范围的本领人员。

本创造采用的试材皆为普遍市售品皆可于商场购得。

底下参照简直实行例闭于本创造进行刻画须要证明的是这些实行例只是是刻画性的而不以所有办法节制本创造。

实行例1活性炭增添量闭于紫菜高效水解酶制剂比生机的效率

(1)怪僻的100g鲍鱼内脏用净水洗洁经绞肉机绞成浆状赢得鲍鱼内脏浆;鲍鱼内脏浆中介入500ml20mmtris-hcl缓冲液混共后放置在构造捣碎机中匀浆在4℃前提下10000×g离心20min后绢布过滤收集滤液在滤液中介入2.0%(w/v)大概2.5%(w/v)活性炭褪色在20℃下水浴处置1.5h后取出在4℃前提下10000×g离心20min取上清备用。

(2)将紫菜研磨成粉后再过100目筛埋躲留搞燥的瓶子中屡屡试验取出3.0g加10倍体积20mmtris-hcl的缓冲液经过构造捣碎机充溢捣碎之后放在磁力搅拌器上从来搅拌保护紫菜溶液均匀。

(3)在2ml离心管中顺序介入600μl办法(2)的紫菜溶液和50μl办法(1)的上清液充溢混匀后在37℃前提下反应30min反应完成后在沸水浴灭酶15min经10000×g离心10min取上清200μl加到600μldns试剂中混共均匀后在95℃前提下显色15min登时用冰水冷却加蒸馏水定容至5ml于波长540nm处测其吸光度值酶活定义为:在37℃的前提下每分钟领会1%羧甲基纤维素钠爆发1μmol/l还天性糖所需的酶量定义为1个酶生机单元截止如图1所示。

如图1可知:活性炭增添量为2.5%所得上清液酶活较高酶活为30000u/g。

实行例2不共洗脱柱体积闭于紫菜高效水解酶制剂接收率和生机的效率

(1)怪僻的100g鲍鱼内脏用净水洗洁经绞肉机绞成浆状赢得鲍鱼内脏浆;鲍鱼内脏浆中介入500ml20mmtris-hcl缓冲液混共后放置在构造捣碎机中匀浆在4℃前提下10000×g离心20min后绢布过滤收集滤液在滤液中介入2.5%(w/v)活性炭褪色在20℃下水浴处置1.5h后取出在4℃前提下10000×g离心20min取上清备用。

(2)将办法(1)中所得上清上样于串联离子调换树脂顺序用20个柱体积的20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)、20个柱体积的20mmhac-nac缓冲液(ph5.5)和蒸馏水洗脱个中蒸馏水的洗脱柱体积分别安排为10、15、20个柱体积收集蒸馏水洗脱所得组分三个洗脱柱体积闭于应的洗脱组分分别定名为酶液1、酶液2和酶液3。

(3)将紫菜研磨成粉后再过100目筛埋躲留搞燥的瓶子中屡屡试验取出3.0g加10倍体积20mmtris-hcl的缓冲液经过构造捣碎机充溢捣碎之后放在磁力搅拌器上从来搅拌保护紫菜溶液均匀。

(4)在2ml离心管中顺序介入600μl办法(3)的紫菜溶液和50μl办法(2)的酶液充溢混匀后在37℃前提下反应30min反应完成后在沸水浴灭酶15min经10000×g离心10min取上清200μl加到600μldns试剂中混共均匀后在95℃前提下显色15min登时用冰水冷却加蒸馏水定容至5ml于波长540nm处测其吸光度值酶活定义为:在37℃的前提下每分钟领会1%羧甲基纤维素钠爆发1μmol/l还天性糖所需的酶量定义为1个酶生机单元截止如图2所示。

如图2可知:蒸馏水洗脱体积为15个柱体积时酶生机为28500u/g接收率达到95%。

实行例3紫菜水解酶制剂与市售纤维素酶酶解紫菜闭于比

(1)怪僻的100g鲍鱼内脏用净水洗洁经绞肉机绞成浆状赢得鲍鱼内脏浆;鲍鱼内脏浆中介入500ml20mmtris-hcl缓冲液混共后放置在构造捣碎机中匀浆在4℃前提下10000×g离心20min后绢布过滤收集滤液在滤液中介入2.5%(w/v)活性炭褪色在20℃下水浴处置1.5h后取出在4℃前提下10000×g离心20min取上清备用。

(2)将办法(1)中所得上清上样于串联离子调换树脂顺序用20个柱体积的20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)、20个柱体积的20mmhac-nac缓冲液(ph5.5)和15个柱体积的蒸馏水洗脱收集蒸馏水洗脱所得组分。个中串联离子调换树脂为阴离子调换树脂和阳离子调换树脂串联阴离子调换树脂为q-sepharose阳离子调换树脂为sp-sepharose二者均为美国ge公司产品。

(3)将办法(2)中洗脱后串联离子调换树脂顺序用2mnacl、蒸馏水和20mmtris-hcl缓冲液进行复活处置。

(4)将办法(2)收集的组分上样于扣留分子量为10000da的超滤膜进行超滤浓缩至固形物浓度为10%得浓缩物。

(5)将浓缩物冷冻搞燥收集搞燥粉末即得紫菜水解酶制剂。

(6)将紫菜研磨成粉后再过100目筛埋躲留搞燥的瓶子中屡屡试验取出3.0g加10倍体积20mmtris-hcl的缓冲液经过构造捣碎机充溢捣碎之后放在磁力搅拌器上从来搅拌保护紫菜溶液均匀。

(7)在2ml离心管中顺序介入600μl办法(6)紫菜溶液和50μl办法(5)的紫菜水解酶酶液(10mg/ml)和市售纤维素酶(购于南宁庞博生物工程有限公司食物增添剂类)(20mg/ml)充溢混匀后在37℃前提下反应30min反应完成后在沸水浴灭酶15min经10000×g离心10min取上清200μl加到600μldns试剂中混共均匀后在95℃前提下显色15min登时用冰水冷却加蒸馏水定容至5ml于波长540nm处测其吸光度值酶活定义为:在37℃的前提下每分钟领会1%羧甲基纤维素钠爆发1μmol/l还天性糖所需的酶量定义为1个酶生机单元依照比率安排浓度普遍紫菜水解酶制剂和市售纤维素酶的酶活。

(8)在2ml离心管中顺序介入600μl办法(6)紫菜溶液和50μl办法(5)的紫菜水解酶酶液(300u/g)和市售纤维素酶(300u/g)充溢混匀后在37℃前提下反应30min反应完成后在沸水浴灭酶15min经10000×g离心10min取上清200μl加到600μldns试剂中混共均匀后在95℃前提下显色15min登时用冰水冷却加蒸馏水定容至5ml于波长540nm处测其吸光度值酶活定义为:在37℃的前提下每分钟领会1%紫菜多糖爆发1μmol/l还天性糖所需的酶量定义为1个酶生机单元截止如图3所示。

由图3可知:在紫菜水解酶制剂和市售纤维素酶酶活沟通的前提下运用二种酶领会紫菜与市售纤维素酶比拟紫菜水解酶酶液酶解效力是市售纤维素酶的240%。

实行例4紫菜水解酶制剂与市售纤维素酶酶解紫菜形态变革闭于比

(1)怪僻的100g鲍鱼内脏用净水洗洁经绞肉机绞成浆状网站推广经绞肉机绞成浆状赢得鲍鱼内脏浆;鲍鱼内脏浆中介入500ml20mmtris-hcl缓冲液混共后放置在构造捣碎机中匀浆在4℃前提下10000×g离心20min后绢布过滤收集滤液在滤液中介入2.5%(w/v)活性炭褪色在20℃下水浴处置1.5h后取出在4℃前提下10000×g离心20min取上清备用。

(2)将办法(1)中所得上清上样于串联离子调换树脂顺序用20个柱体积的20mmtris-hcl缓冲液(ph8.0)、20个柱体积的20mmhac-nac缓冲液(ph5.5)和15个柱体积的蒸馏水洗脱收集蒸馏水洗脱所得组分。个中串联离子调换树脂为阴离子调换树脂和阳离子调换树脂串联阴离子调换树脂为q-sepharose阳离子调换树脂为sp-sepharose二者均为美国ge公司产品。

(3)将办法(2)中洗脱后串联离子调换树脂顺序用2mnacl、蒸馏水和20mmtris-hcl缓冲液进行复活处置。

(4)将办法(2)收集的组分上样于扣留分子量为10000da的超滤膜进行超滤浓缩至固形物浓度为10%得浓缩物。

(5)将浓缩物冷冻搞燥收集搞燥粉末即得紫菜水解酶制剂。

(6)称取0.3g紫菜于培养皿中介入10倍体积20mmtris-hcl缓冲液持续介入0.5%办法(5)的紫菜水解酶制剂和0.5%市售纤维素酶搅拌均匀在45℃下进行酶解。每1h记录一次酶解紫菜的形态变革酶解形态变革如图4所示个中a、b分别为紫菜水解酶制剂和市售纤维素酶酶解紫菜形态变革图。

如图4可知:紫菜水解酶制剂在酶解2h后便不妨明显的参瞅到紫菜从长条状酶解为碎片状而纤维素酶在4h后才可参瞅到此变革瞅来紫菜水解酶制剂可高效酶解紫菜。

综上依据本创造的实行例采用缓冲液提取、活性炭褪色、串联离子调换色谱和超滤浓缩的办法可制备紫菜高效水解酶制剂以高效的水解紫菜使紫菜赢得高效力用。

在本证明书籍的刻画中参照术语“一个实行例”、“一些实行例”、“示例”、“简直示例”、大概“一些示例”等的刻画意指共同该实行例大概示例刻画的简直特性、构造、材料大概者特性包括于本创造的起码一个实行例大概示例中。在本证明书籍中闭于上述术语的表示性表述不应领会为必定针闭于的是沟通的实行例大概示例。而且刻画的简直特性、构造、材料大概者特性不妨在所有的一个大概多个实行例大概示例中以适合的办法共同。其他本范围的本领人员不妨将本证明书籍中刻画的不共实行例大概示例进行结合和拉拢。

纵然上头已经示出和刻画了本创造的实行例不妨领会的是上述实行例是示例性的不行领会为闭于本创造的节制本范围的普遍本领人员在本创造的范畴内不妨闭于上述实行例进行变革、建改、替代和变型。

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