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包含巨大芽孢杆菌属益生菌菌株和多不饱和脂肪酸组分的制剂的制作方法 (巨大芽孢杆菌怎么培养)

来源: 浏览:2次  更新时间:2021-11-23 21:27

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多粘类芽孢杆菌的作用

包括宏大芽孢杆菌属益生菌菌株和多不饱和脂肪酸组分的制剂的创造办法
包括宏大芽孢杆菌属益生菌菌株和多不饱和脂肪酸组分的制剂
1.本创造波及一种制剂其包括起码一种属于宏大芽孢杆菌(bacillus megaterium)属的益生菌菌株大概宏大芽孢杆菌的提取物以及多不饱和脂肪酸组分雅虎香港以及多不饱和脂肪酸组分所述多不饱和脂肪酸组分包括选自二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(ara)、α亚麻酸、亚麻油酸(stearidonic acid)、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、亚油酸、γ

亚麻酸和/大概其衍生物的起码一种ω

3大概ω

6脂肪酸。
2.ω

3脂肪酸即α

亚油酸(ala)、epa和dha的饮食摄入闭于人体兴盛特别是闭于比方类风湿闭节炎的革新和血汗管疾病伤害因素的缩小有益[1、2]。百般海鲜产品是饮食中epa/dha的根源然而其消耗量常常不及以满脚倡导的饮食限额(常常每天500mg epa和dha)[3]。这一缺口经过款待运用含有ω

3脂肪酸的膳食补充剂大概加强食物来弥合[4]。膳食补充剂是养分物质大概具备养分大概心理效率的其他物质的会合根源其手段是补充平常饮食(www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/food

supplements)。比方ω

3脂肪酸补充剂常常含有来自鱼油、磷虾油大概藻类的epa/dha的甘油三酯大概ω

3乙酯。
[0003]
ω

3脂肪酸常常具备抗炎效率、心脏和神经保护效率[2、5]。它们的效率办法包括直接驱除活性氧变化细胞膜震动性(其继而效率细胞旗号转导事变)安排转录因子诸如pparg和nfkappab(其安置促炎和抗炎细胞因子的生物合成)的活性和比赛性排斥经过环氧合酶和脂氧合酶变化为促炎细胞因子的基质。
[0004]
迩来已审定出ω

3和ω

6脂肪酸的几种氧合产品并将其功效表征为其有益的兴盛效率的闭头介质特别是在革新缓性炎症病况方面[6]。这些产品包括maresin(mar)、e

和d

系列消退素(rve和rvd)、保护素、脂氧素及其前体比方18

羟基

二十碳五烯酸(18

hepe)、17

羟基

二十二碳六烯酸(17

hdha)和17,18

环氧二十碳四烯酸(17,18

eeq)统称为特化促炎症消退(pro

resolving)脂质介质(spm)。spm由脂氧合酶、环氧合酶2和细胞色素p450单加氧酶(cyp450)内源性产生并充任活性炎症消退的灵验冲动剂经过纳摩尔浓度的g蛋白偶联受体进行旗号传导。在运用啮齿动物的探究中证精确spm针闭于多种熏染性和炎性疾病的灵验性[6]。比方rve1、rvd2、保护素d1(pd1)和lxa4巩固致病性牙龈假单胞菌(pseudomonas gingivalis)[7]、大肠杆菌(e.coli)[8]、简单疱疹(herpes simples)[9]、念珠菌(candida)[10]、h5n1流感[11]的驱除率。
[0005]
lxa4、lxb4、rve1、rve3、rvd1

5、rvd2、pd1、mar1、mar2在牙周炎、囊性纤维化、神经炎症、缺血性中风、阿尔茨海默病[12]、动脉粥样强硬[13]、非酒精性脂肪肝疾病[14]、角膜伤害[15]、视网膜病变[16]、青光眼[17]、结肠炎[18]、哮喘[19、20]、胰岛素抗性[14]、闭节炎[21]和痛痛[22]的模型中具备保护效率。其他spm的几种前体自己已表露表现消退效率。比方18

羟基

二十碳五烯酸(18

hepe)经过制止单核细胞与血管内皮细胞的粘附[23]和经过制止压力超负荷诱发的符合不良的心脏沉塑[24]来抵消血汗管疾病的展开。好像地17,18

eeq具备心脏保护、抗心律不齐、血管舒弛和抗炎个性[5]。肠神经胶质细胞的ara衍生的15

hete的旁渗透救济肠障碍功效其是在比方克罗恩病中受到损害的过程[25]。
[0006]
然而将这些有憧憬的临床前创造截止变化用于革生人类兴盛已表露具备挑拨
性。如在试验探究中所干的那样经过静脉内大概腹膜内打针直接递送spm闭于人类而言是不可行的特别是在预防办法的情景下。含spm大概spm前体的补充剂大概食物的口服递送是不对理的因为它们在生物体液中的半衰期相闭于较短因此它们不太大概达到其靶构造。在这方面wo 2017/041094果然了一种浓缩的酯化鱼油其仅包括约0.0005%的18

hepe和17

hdha而且以至经过超临界流体萃取富集这些spm前体也不会爆发胜过0.05%(18

hepe+17

hdha)/总ω

3。
[0007]
运用epa/dha的临床考查得出未定定的大概作废的截止特别是闭于于患有炎症性肠病、哮喘和代谢综合征特性的病号[2]。这种闭于人类的便宜的缺乏与spm闭于相应动物疾病模型的灵验调节产生了明显闭于比[6]。咱们认为将ω

3(和ω

6)变化为spm是至闭沉要的办法这闭于于从旨在运用多不饱和脂肪酸(pufa)预防、调节大概调节炎性疾病的所有搞预措施递送成功的截止至闭沉要。咱们还认为爆发spm的机构在某些前提下是功效失调的。这一构想赢得了在糖尿病伤口[26]、代谢综合征[27]、哮喘[19、28]、溃疡性结肠炎[29]、克罗恩病[25]和牙周炎[30]中缩小的(局部大概轮回)spm程度以及严沉哮喘[28]、溃疡性结肠炎[29]、囊性纤维化[31]、牙周炎[30]和阿尔茨海默氏病[12]中缩小的spm爆发酶的表白大概活性的创造截止的救济。
[0008]
因此本创造的手段是供给一种促进生物体内spm产生的本领从而在仅补充ω

3几乎不大概不博得成功时为蒙受上述病况而且须要新的战术来预防、革新大概治愈此类和好像病况的人和动物戴来便宜。
[0009]
经过本创造经过将适合的ω

3源与新创造的微生物spm消费者在适合的制剂中拉拢来实行该手段使得与径自的ω

3源比拟该拉拢本领供给巩固的和/大概靶向的功效。适合的制剂答应组分在小肠远端的胃肠道中伴随开释从而预防ω

3源被小肠接收并使其更易于被微生物spm消费者代谢。
[0010]
spm的生物合成已经针闭于真核细胞特别是粒细胞和单核细胞进行了留神刻画。巨噬细胞不妨表白spm生物合成所需的十脚酶;其他仅表白选定酶的细胞典型不妨与补体细胞所有表白。在肥大细胞中创造alox5在皮肤和上皮细胞中创造alox12在树突状细胞和肠神经胶质细胞中创造alox15[25]在上皮细胞中创造cox

2和cyp450亚共种型。
[0011]
基于肠道菌群决定个别闭于食物因素的反应并登时变化兴盛截止咱们将其审定为咱们的促进内源性spm消费的本领办法的靶标。靶向微生物群的战术常常包括运用益生元和益生菌旨在变化微生物群的构成和活性。益生菌是活的微生物当以脚够的量施用时其赋予宿主兴盛便宜(fao

who;probiotics in food.health and nutritional properties and guidelines for evaluation;fao food and nutritional paper 85,2006)。益生元救济有益微生物的成长。已经刻画了ω

3脂肪酸的益生元效率[32、33]然而反之亦然雅虎邮箱然而反之亦然肠微生物闭于ω

3的大概的代谢效率尚待决定并已在本创造中果然。肠道驻留微生物中耗氧酶的存留受到节制;胃肠道细菌和古细菌犹如不存留环氧合酶和脂氧合酶然而致病性铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)表白的15

脂氧合酶之外[34]。cyp450单加氧酶已在芽孢杆菌属中被检测到[35]。cyp102a1(也称为cyp450bm

3)是一种在宏大芽孢杆菌中创造的双功效酶其经过连接的加氧酶和还本酶活性催化nadph依附性的多不饱和脂肪酸的羟基化反应。该p450体系由具备二个不共的构造域的多肽链构成一个构造域包括血红蛋白另一个构造域包括fad还本酶。这种细菌细胞色素p450典型是可溶的并经过
degussa gmbh的表面以上文提及的登录号于2018年11月27日(dsm 32963)和2019年10月17日收躲于dsmz。
[0022]
因此用于依据本创造的制剂的宏大芽孢杆菌菌株选自以下组:
[0023]
a)以dsm 32963、dsm 33296和dsm 33299收躲于dsmz的宏大芽孢杆菌菌株之一;
[0024]
b)以dsm 32963收躲的宏大芽孢杆菌菌株的渐变体其具备dsm 32963菌株的十脚审定特性个中所述渐变体优选与dsm 32963菌株具备起码95%优选起码96、97大概98%更优选起码99大概99.5%的dna序列普遍性;
[0025]
c)(a)大概(b)的制剂;
[0026]
d)包括如包括在(a)、(b)大概(c)中的代谢物的灵验混共物的制剂。
[0027]
以dsm 32963收躲于dsmz的宏大芽孢杆菌菌株展现出以下特性序列:
[0028]
a)与依据seq id no:1大概seq id no:2的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的16s rdna序列;
[0029]
b)与依据seq id no:3的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的yqfd序列;
[0030]
c)与依据seq id no:4的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的gyrb序列;
[0031]
d)与依据seq id no:5的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的rpob序列;
[0032]
e)与依据seq id no:6的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的groel序列。
[0033]
以dsm 33296收躲于dsmz的宏大芽孢杆菌菌株展现出以下特性序列:
[0034]
a)与依据seq id no:13大概seq id no:14的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的16s rdna序列;
[0035]
b)与依据seq id no:15的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的yqfd序列;
[0036]
c)与依据seq id no:16的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的gyrb序列;
[0037]
d)与依据seq id no:17的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的rpob序列;
[0038]
e)与依据seq id no:18的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)序列普遍性的groel序列。
[0039]
以dsm 33299收躲于dsmz的宏大芽孢杆菌菌株展现出以下特性序列:
[0040]
a)与依据seq id no:25大概seq id no:26的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的16s rdna序列;
[0041]
b)与依据seq id no:27的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的yqfd序列;
[0042]
c)与依据seq id no:28的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的gyrb序列;
[0043]
d)与依据seq id no:29的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列共
一性的rpob序列;
[0044]
e)与依据seq id no:30的多核苷酸序列具备起码99.5%(更加是100%)的序列普遍性的groel序列。
[0045]
因此本创造的另一中心是宏大芽孢杆菌菌株特别是如上文所述的宏大芽孢杆菌菌株其展现出以下特性中的起码一个优选理想:
[0046]
a)与依据seq id no:1大概seq id no:2、seq id no:13大概seq id no:14、seq id no:25大概seq id no:26的多核苷酸序列具备起码99%、优选起码99.5%、更优选起码99.8%大概99.9%、更加是100%的序列普遍性的16s rdna序列;
[0047]
b)与依据seq id no:3、seq id no:15大概seq id no:27的多核苷酸序列具备起码99%、优选起码99.5%、更优选起码99.8%大概99.9%、更加是100%的序列普遍性的yqfd序列;
[0048]
c)与依据seq id no:4、seq id no:16、seq id no:28的多核苷酸序列具备起码99%、优选起码99.5%、更优选起码99.8%大概99.9%、更加是100%的序列普遍性的gyrb序列。
[0049]
优选地该宏大芽孢杆菌菌株展现出以下进一步的特性中的起码一个更优选理想:
[0050]
d)与依据seq id no:5、seq id no:17、seq id no:29的多核苷酸序列具备起码99%、优选起码99.5%、更优选起码99.8大概99.9%、更加是100%的序列普遍性的rpob序列;
[0051]
e)与依据seq id no:6、seq id no:18、seq id no:30的多核苷酸序列具备起码99%、优选起码99.5%、更优选起码99.8%大概99.9%、更加是100%的序列普遍性的groel序列。
[0052]
因此本创造的一个特定中心仍旧宏大芽孢杆菌菌株其展现出以下特性:
[0053]
a)依据seq id no:1大概seq id no:2、seq id no:13大概seq id no:14大概seq id no:25大概seq id no:26的16s rdna序列;
[0054]
b)依据seq id no:3、seq id no:15大概seq id no:27的yqfd序列;
[0055]
c)依据seq id no:4、seq id no:16大概seq id no:28的gyrb序列。
[0056]
优选地该宏大芽孢杆菌菌株展现出以下进一步的特性:
[0057]
d)依据seq id no:5、seq id no:17大概seq id no:29的rpob序列;
[0058]
e)依据seq id no:6、seq id no:18大概seq id no:30的groel序列。
[0059]
在有利的摆设中epa和dha为游离脂肪酸、盐、天然甘油三酯、鱼油、磷脂酯大概ω

3乙酯的办法。
[0060]
epa和dha动作脂肪酸盐增添时被益生菌菌株灵验地变化为spm其消费和运用已在之前表露。wo2016102323a1刻画了包括多不饱和ω

3脂肪酸盐的拉拢物其不妨保卫氧化宁静存留。wo2017202935a1果然了一种制备包括ω

3脂肪酸盐和胺的拉拢物的办法个中包括一种大概多种ω

3脂肪酸、一种大概多种碱性胺和20沉量%大概更少的水(基于糊剂的总沉量)的糊剂被捏合直至赢得均质的糊剂。
[0061]
因此在本创造的优选摆设中ω

3组分包括ω

3脂肪酸氨基酸盐个中所述氨基酸选自碱性氨基酸所述碱性氨基酸选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、组氨酸、瓜氨酸、胆碱及其混共物。
[0062]
在另一个优选的摆设中氨基酸采用自选自赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱及其混共物的碱性氨基酸。
[0063]
最优选运用赖氨酸的氨基酸盐。
[0064]
本创造的另一优选摆设是ω

3分别体(猜测是脂质体)的制剂以进一步普及闭于益生菌菌株的生物运费用。如许的分别机制剂优选由磷脂混共物(比方脱油的往日葵卵磷脂)大概决定的磷脂比方二油基磷脂酰胆碱(dopc)构成。如许的分别机制剂的最优选办法包括游离的ω

3脂肪酸盐大概游离的ω

3脂肪酸。
[0065]
因此在该优选的实行筹备中多不饱和脂肪酸组分包括包括起码一种磷脂和起码一种ω

3脂肪酸的分别体的制剂。
[0066]
在另一个优选的实行筹备中多不饱和脂肪酸组分包括包括起码一种磷脂和阳离子与衍生自ω

3大概ω

6脂肪酸的阴离子的起码一种脂肪酸盐的分别体的制剂。特别优选运用ω

3脂肪酸。
[0067]
在本创造的代替摆设中磷脂是脱油的磷脂其包括大于40沉量%、优选70沉量%、更优选大于90沉量%的磷脂酰胆碱含量和小于5沉量%、优选小于1沉量%的磷脂酰乙醇胺含量。
[0068]
在一个代替的实行筹备中磷脂是油酸和/大概亚油酸含量大于总脂肪酸的70沉量%的非氢化磷脂。
[0069]
在本创造的另一优选摆设中磷脂与脂肪酸盐的品质比大于0.001优选大于0.05更优选大于0.01更优选大于0.09最优选大于0.39。
[0070]
在一个代替的实行筹备中所述制剂为粉末大概液体办法当与水在ph 6.5至7.5的ph值下混共时其爆发平稳粒径小于1μm、优选小于500nm、最优选小于250nm的胶体分别体。
[0071]
在另一个实行筹备中组分彼此精致分别使得磷脂和脂肪酸盐均以100μg大概更小的量存留和可检测到。
[0072]
用于本创造制剂的肠内递送的优选制剂是供给针闭于胃病况的保护的制剂大概供给在小肠中制剂的靶向开释的制剂大概供给在大肠中制剂的靶向开释的制剂。因此在优选的实行筹备中制剂包括用于减速开释大概肠大概结肠开释的包衣。
[0073]
本创造的一个中心是依据本创造的制剂动作饲料大概食物补充剂的用途大概其在食物中的用途。依据本创造的优选食物是巧克力产品、软糖、麦片、麦片条和乳成品。
[0074]
本创造的另一个中心是本创造的制剂动作饲料大概食物产品中的合益素因素的用途。
[0075]
本创造的另一个中心是一种饲料大概食物拉拢物其包括依据本创造的制剂和起码一种其他的饲料大概食物因素优选地选自蛋白质、碳水化合物、脂肪、其他益生菌、益生元、酶、维生素、免疫安排剂、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、基于酸的产品、药物及其拉拢。
[0076]
依据本创造的饲料大概食物拉拢物还包括丸剂、胶囊、片剂大概液体办法的膳食补充剂。
[0077]
本创造的另一个中心是药物拉拢物其包括依据本创造的制剂和药学上可接收的载体。
[0078]
本创造的另一中心是制剂在制备药物产品中的用途。
[0079]
当将本创造的制剂施用于动物大概人类时优选革新兴盛状况特别是动物大概人类
的肠道兴盛、血汗管兴盛、心脏代谢兴盛、肺兴盛、闭节兴盛、眼睛兴盛、精力兴盛、口腔兴广博概免疫兴盛。
[0080]
因此本创造的另一个中心是动作本创造的一局部的依据本创造的拉拢物其用于革新兴盛状况特别是动物大概人类的肠道兴盛、血汗管兴盛、心脏代谢兴盛、肺兴盛、闭节兴盛、眼睛兴盛、精力兴盛、口腔兴广博概免疫兴盛。
[0081]
依据本创造的有利摆设是用于经过以下一种大概多种革新动物大概人的兴盛状况的拉拢物:
[0082]

通经过其经过胃肠道微生物的爆发减少宿主中以下脂质介质的总量:
[0083]
17

羟基

dha(17

hdha)14

羟基

dha(14

hdha)13

羟基

dha(13

hdha)7

羟基

dha(7

hdha)4

羟基

dha(4

hdha)18

羟基

二十碳五烯酸(18

hepe)15

羟基

二十碳五烯酸(15

hepe)12

羟基

二十碳五烯酸(12

hepe)11

羟基

二十碳五烯酸(11

hepe)8

羟基

二十碳五烯酸(8

hepe)5

羟基

二十碳五烯酸(5

hepe)15

羟基

二十碳四烯酸(15

hete)12

羟基

二十碳四烯酸(12

hete)雅虎邮箱12

羟基

二十碳四烯酸(12

hete)11

羟基

二十碳四烯酸(11

hete)8

羟基

二十碳四烯酸(8

hete)5

羟基

二十碳四烯酸(5

hete)9

羟基

十八碳二烯酸(9

hode)13

羟基

十八碳二烯酸酸(13

hode)19z

二十二碳六烯酸(pdx)保护素d1(pd1)阿司匹林触发的pd1(at

pd1)马林素1(mar1)马林素2(mar2)白三烯b4(ltb4)t

ltb4消退素d1

5(rvd1

5)阿司匹林触发的rvd1(at

rvd1)消退素e1(rve1)消退素e3(rve3)脂氧素a4(lxa4)脂氧素a5(lxa5)脂氧素b4(lxb4)脂氧素b5(lxb5)
[0084]

减少宿主中epa的总量
[0085]

减少宿主中dha的总量
[0086]
本创造的另一个中心是本创造的制剂运用适合的基质大概载体在闭于皮肤、眼睛和在口腔中的局部运用中的用途。
[0087]
在优选的摆设中将制剂承载在包括纳米纤维素的预合成多相生物材料上和/大概中个中所述纳米纤维素是选自以下的细菌合成的纳米纤维素(bnc):
[0088]

包括纤维素纤维大概纳米晶须的搜集的bnc
[0089]

包括二个大概更多个不共层的纤维素本纤维的bnc个中每个层来由自不共微生物大概来宁静不共前提下培养的微生物的bnc构成
[0090]

包括起码二个不共的纤维素搜集的bnc大概
[0091]

bnc复合材料其进一步包括会合物。
[0092]
纳米纤维素是指纳米构造纤维素的术语。它不妨是纤维素纳米晶体(cnc大概ncc)、也称为微纤化纤维素(mfc)的纤维素纳米纤维(cnf)大概细菌纳米纤维素(bnc)其是指由细菌爆发的纳米构造纤维素。bnc是一种由诸如komagataeibacter xylinus的菌株爆发的纳米纤维会合物该komagataeibacter xylinus是在纤维素消费中效力最高的最佳细菌种之一。bnc是具备特殊的个性的生物材料该特性为比方:化学纯度杰出的板滞强度高灵活性高接收性因为特殊是的可成型性和柔嫩性而具备产生所有形状和尺寸的大概性等。其他该材料是素食的和庄重素食的而且具备高水分含量。
[0093]
细菌纤维素是三维搜集而且是固定和捕获微生物及其他物质的载体。固定的生物材料(包括微生物)用于生物活性代谢物(比方抗微生物剂、代谢生物活性物)的本位/体内生物合成触发微生物和生物活性物的开释和/大概用效率于发酵过程的固定微工厂。
[0094]
本创造的另一中心仍旧展现出以下特性的休眠办法的大概动作养分细胞的宏大芽孢杆菌菌株用于spm的生物本领消费的用途:
[0095]
a)与依据seq id no:1大概seq id no:2、seq id no:13大概seq id no:14、seq id no:25大概seq id no:26的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列普遍性的16s rdna序列;和/大概
[0096]
b)与依据seq id no:3、seq id no:15大概seq id no:27的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列普遍性的yqfd序列;和/大概
[0097]
c)与依据seq id no:4、seq id no:16、seq id no:28的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列普遍性的gyrb序列;和/大概
[0098]
d)与依据seq id no:5、seq id no:17、seq id no:29的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列普遍性的rpob序列;和/大概
[0099]
e)与依据seq id no:6、seq id no:18、seq id no:30的多核苷酸序列具备起码99.5%、更加是100%的序列普遍性的groel序列。
[0100]
处究竟行例
[0101]
实行例1:宏大芽孢杆菌菌株dsm 32963、dsm 33296和dsm 33299各自具备用于细胞色素p450单加氧酶(cyp450)的遗传序列。
[0102]
宏大芽孢杆菌菌株dsm 32963、dsm 33296和dsm 33299各自从来自威斯特伐利亚东部的本始花圃的土壤样品平分别而来。它们已依据国际承认用于博利步调的微生物保持的布达佩斯公约的决定以evonik degussa gmbh的表面以上文提及的登录号于2018年11月27日(dsm 32963)和2019年10月17日收躲于dsmz。
[0103]
宏大芽孢杆菌dsm 32963的基因组序列含有编码在氨基酸程度上与宏大芽孢杆菌atcc 14581(aaa87602.1)的p450 bm3(cyp102a1)具备97.9%的普遍性的蛋白质的基因[seq id no:7]。该酶包括p450加氧酶和nadph:p

450还本酶二者[46]。p450 bm3的天然底物经领会为长链脂肪酸(c12至c20)其仅在近终局地位被羟基化(ω

1至ω

3)[47]。
[0104]
与p450 bm3比拟闭于于在宏大芽孢杆菌dsm 32963的基因组序列内审定的序列参瞅到局部掷中序列在氨基酸程度上21.1%至30.5%的较矮序列好像性。与p450 bm3比拟这些其他潜伏的细胞色素基因大概具备好像的功效[seq id no:8

12](参睹表1)。
[0105]
表1:针闭于宏大芽孢杆菌dsm 32963的蛋白质序列的p450 bm3的blastp(掷中列中的seq id是指相应的核苷酸序列)
[0106]
[0107]
宏大芽孢杆菌dsm 33296的基因组序列含有编码在氨基酸程度上与宏大芽孢杆菌atcc 14581(aaa87602)的p450 bm3(cyp102a1)具备98.9%的普遍性的蛋白质的基因[seq id no:19]。该酶包括p450加氧酶和nadph:p

450还本酶二者[46]。p450 bm3的天然底物经领会为长链脂肪酸(c12至c20)其仅在近终局地位被羟基化(ω

1至ω

3)[47]。
[0108]
与p450 bm3比拟闭于于在宏大芽孢杆菌dsm 33296的基因组序列内审定的序列参瞅到局部掷中序列在氨基酸程度上21.5%至30.7%的较矮序列好像性。与p450 bm3比拟这些其他潜伏的细胞色素基因大概具备好像的功效[seq id no:20

24](参睹表2)。
[0109]
表2:针闭于宏大芽孢杆菌dsm 33296的蛋白质序列的p450 bm3的blastp(掷中列中的seq id是指相应的核苷酸序列)
[0110][0111]
宏大芽孢杆菌dsm 33299的基因组序列含有编码在氨基酸程度上与宏大芽孢杆菌atcc 14581(aaa87602.1)的p450 bm3(cyp102a1)具备96.1%的普遍性的蛋白质的基因[seq id no:31]。该酶包括p450加氧酶和nadph:p

450还本酶二者[46]。p450 bm3的天然底物经领会为长链脂肪酸(c12至c20)其仅在近终局地位被羟基化(ω

1至ω

3)[47]。
[0112]
与p450 bm3比拟闭于于在宏大芽孢杆菌dsm 33299的基因组序列内审定的序列参瞅到局部掷中序列在氨基酸程度上20.9%至30.5%的较矮序列好像性。与p450 bm3比拟这些其他潜伏的细胞色素基因大概具备好像的功效[seq id no:32

37](参睹表3)。
[0113]
表3:针闭于宏大芽孢杆菌dsm 33299的蛋白质序列的p450 bm3的blastp(掷中列中的seq id是指相应的核苷酸序列)
[0114][0115]
实行例2:在磷酸盐缓冲液顶用二油基磷脂酰胆碱(dopc)制备ω

3脂肪酸分别体
[0116]
为了制备ω

3脂肪酸分别体的制剂将0.8g的二油基磷脂酰胆碱(dopclipoid gmbh)融化在1ml的乙醇中。增添并融化0.2克鱼油(ω

3 1400)、ω

3乙酯(500:200eebasf)大概ω

3赖氨酸盐办法的游离ω

3脂肪酸的赖氨酸盐(evonik)。在游离的ω

3脂肪酸盐的情景下增添20μl蒸馏水以实脚融化产品。
[0117]
办法为ω

3赖氨酸盐的游离ω

3脂肪酸的赖氨酸盐(evonik)含有约67%的脂肪酸和洪量的ω

3脂肪酸epa和dha以及少许的ω

3脂肪酸二十二碳五烯酸和ω

6脂肪酸花生四烯酸、二十二碳四烯酸和二十二碳烯酸异构体。
[0118]
在45℃的温度下和在激烈搅拌下将1ml的相应溶液逐滴介入到20ml的ph=8的0.1m磷酸盐缓冲液中。之后将分别体置于冰上并超声处置(branson sonifier100%振幅50%脉冲)15分钟以爆发纳米级分别体猜测是脂质体。结果将分别体经过0.2μm打针器过滤器进行无菌过滤。经过理想光散射(dls)测量(zetasizer nano zsmalvern)表征所得分别体的粒度。该分别体包括40g/l的磷脂和10g/l的ω

3脂肪酸大概酯。
[0119]
实行例3:宏大芽孢杆菌株菌dsm 32963不妨爆发细胞内18

羟基

二十碳五烯酸(18

hepe)
[0120]
闭于于宏大芽孢杆菌dsm 32963不妨证明爆发spm的酶的相闭的细胞内活性。从具备0.1%葡萄糖(lbg)的10ml luria bertami肉汤(lbthermo fisher scientific)中将宏大芽孢杆菌dsm 32963的培养物在100ml培养瓶中于30℃和200rpm培养24h。将完备的培养物变化至lbg中的200ml主培养物中。主培养物在2升培养瓶中于30℃和200rpm成长6小时。而后以10ml的体积份收获细胞培养物经过离心(15min4000rpm室温)取消上清液并
将细胞积淀分别沉悬于10ml lbg和2ml补充剂中(表2)。将这些培养物在100ml摇瓶中于30℃和200rpm孵育16小时。
[0121]
将不共办法的二十碳五烯酸(epa)和二十二碳六烯酸(dha)源增添到宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞培养物中以达到ω

3赖氨酸盐(evonik的)、鱼油(的ω

3 1400)和ω

3乙酯(basf的500:200ee)的办法的0.4g/l的最后浓度。这些物质分别动作超声乳化液和分别机制剂(实行例2中所述的制剂)介入。
[0122]
将不含ω

3脂肪酸含量的dopc制剂和pbs缓冲液用作不含epa的闭于照。
[0123]
表2:补充剂、储液的制备及其epa含量估计值(g/l)
[0124][0125]
经过离心(15分钟4000rpm室温)分别上清液而后各自收获细胞培养物。而后将上清液用由水/乙腈混共物构成的溶剂稀释(上清液:溶剂比率为1:2溶剂构成:65%h2oph8和35%mecn)。将积淀冷冻搞燥过夜并沉悬于由水/乙腈混共物构成的溶剂中(积淀:溶剂比率为1:2溶剂构成:65%h2oph8和35%mecn)。细胞破灭是在ribolyser中的lysing matrix管(0.1mm硅胶球)中进行的。
[0126]
过滤细胞匀浆物(和稀释的上清液)而后将其用于经过lc/esi

ms领会(agilent qqq 6420gemini 3μc6

phenyl)以阳性sim形式在m/z 318下检测18

羟基

二十碳五烯酸(18

hepe)以及在m/z 302下检测前体化合物epa。
[0127]
将epa以具备dopc的ω

3赖氨酸盐、ω

3乙酯、ω

3赖氨酸盐分别体大概具备dopc的鱼油分别体的办法增添到宏大芽孢杆菌细胞中引导18

hepe的细胞相闭(=细胞内+细胞外吸附的)会合(表3)。迄今为止经过增添ω

3赖氨酸盐不妨实行细胞内18

hepe的最高值;其是其他办法的十倍。
[0128]
表3:宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞的细胞提取物中细胞相闭18

hepe的浓度(mg/ml)
[0129][0130]
实行例4:宏大芽孢杆菌dsm 32963和ω

3脂肪酸盐的分别机制剂的合生元拉拢引导细胞外洪量的18

hepe
[0131]
为了探究细胞外展示的18

hepe的量依如实行例1的刻画培养宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞。将细胞沉悬于10ml lbg大概含9.76g/l fessif

v2(biorelevant.com)(其是牛磺胆酸盐、磷脂和其他旨在模仿胆汁表面活性剂的组分的混共物)的lbg并分别增添2ml的补充剂(表2)。其他还将补充剂分别增添到不细胞的摇瓶中的不共培养基中并在沟通前提下进行处置(闭于照)。在30℃和200rpm孵育16h后测定培养上清液和闭于照的18

hepe浓度(表4)。不妨表露宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞不妨从ω

3赖氨酸盐分别体合成18

hepe其是可在细胞外检测的。值得注沉的是经过该办法检测的ω
‑3→
18

hepe的变化率高达0.075这胜过了wo 2017/041094果然的酯化鱼油中0.0005%的18

hepe的前提含量。更沉要的是咱们创造宏大芽孢杆菌菌株将ω

3赖氨酸盐变化为多种(最后)spm产品其浓度以至高于18

hepe(参睹实行例6)这是具备心理道理的。
[0132]
表4:培养上清液和闭于照的测量的18

hepe浓度(mg/l)
[0133][0134]
实行例5:不共芽孢杆菌属种闭于epa的生物变化
[0135]
为了探究不共芽孢杆菌属种爆发细胞内18

hepe的本领依如实行例1所述培养不共种的细胞。将细胞沉悬于10ml含9.76g/l fessif

v2(biorelevant.com)(其是牛磺胆酸盐、磷脂和其他旨在模仿胆汁表面活性剂的组分的混共物)的lbg中并分别增添1.2ml含dopc的ω

3赖氨酸盐分别体。真实行例3中所述测定在30℃和200rpm孵育16小时后细胞的里面18

hepe浓度。
[0136]
仅宏大芽孢杆菌细胞不妨从ω

3赖氨酸盐分别体里面合成18

hepe而枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)则不行。
[0137]
表5:宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞的细胞内测量的18

hepe含量(mg/ml)
[0138][0139]
实行例6:在不共的培养前提下宏大芽孢杆菌dsm 32963从ω

3脂肪酸盐爆发spm
[0140]
脂质代谢组学
[0141]
细菌上清液样品接受运用rp相固相萃取的脂质提取而后依据果然的步调[48]经过超高效液相色谱esi串联质谱领会(uplc

ms/ms)进行领会。在这些前提下大概40种不共的lm(包括5

羟基

二十碳五烯酸5

hepe8

hepe11

hepe12

hepe15

hepe18

hepe5

羟基

二十碳四烯酸(5

hete)8

hete11

hete12

hete15

hete4

羟基

dha(4

hdha)7

hdha13

hdha14

hdha17

hdha消退素a4(lxa4)lxb4消退素e1(rve1)rve3消退素d1

5(rvd1

5)at

rvd1rvd2protectin d1(pd1)at

pd1maresin 1(mar1)mar2)和4种脂肪酸底物不妨以1pg的检测下限被检测到。
[0142]
为了探究除了18

hepe之外宏大芽孢杆菌是否还不妨爆发其他pufa氧合产品进行来自真实行例4中所述培养的宏大芽孢杆菌菌株32963的具备(融化的大概在分别机制剂中)的上清液(具备大概不具备胆汁酸)的脂代谢组学挑选。并行处置和领会制剂的无细胞制剂并将其用作氧合产品的非酶促的自愿产生的闭于照。表6中给出的值表露了产生的产品的洁浓度即减去闭于照值后。不妨瞅出通精致菌已经产生了包括spm在内的许多氧合产品。几种spm的浓度远远胜过了人体血浆样品中创造的spm浓度(其常常在约20

100pg/ml的范畴内)[27、40、41]。为了进行比较人母乳含有约6.000pg/ml rve1和约10.000pg/ml rvd1[42]。计划到spm在nm大概以至pm范畴内在啮齿动物中体内和体本地表现受体介导的效率的究竟[6]表6中表露的创造截止嘈杂表示了本创造的心理和调节沉要性。
[0143]
pufa制剂的典型闭于产品程度(其常常在存留pufa分别机制剂和/大概增添胆汁酸动作增溶剂的情景下更高)有很大的效率。并行地与在不分别机制剂和胆汁酸的情景下用availom处置的样品比拟这些样品中单羟基化spm前体5

hepe、11

hepe、12

hepe、15

hepe、18

hepe、5

hete、8

hete和9

hode的丰采较矮。这不妨经过这些前体向二羟基化和三羟基化脂肪酸的减少的变化来解释。
[0144]
表6:宏大芽孢杆菌dsm 32963细胞的pufa氧合产品的细胞外浓度
[0145][0146]
实行例7:经过其他宏大芽孢杆菌菌株从ω

3脂肪酸盐的分别机制
剂爆发spm
[0147]
挑选了来自不共生境的其他47种宏大芽孢杆菌菌株的spm消费本领以决定这是否是宏大芽孢杆菌种的普遍局面并检测所消费的spm的典型和数手段菌株奇异性分别。真实行例4中所胪陈地培养细胞个中的分别机制剂用作ω

3脂肪酸源。并行地处置和领会的无细胞制剂并将其用作氧合产品的非酶促的自愿产生的闭于照。参瞅到十脚尝试的菌株均爆发可测量的(>1pg/ml)量的百般spm及其前体这些量在菌株之间分别极大(高达2.000倍)而且rve3的浓度在大普遍菌株中特别高(高达1.3μg/ml)。
[0148]
表7中给出的值表露了由二个展现最强的菌株(宏大芽孢杆菌dsm 33296和宏大芽孢杆菌dsm 33299)产生的pufa氧合产品的洁浓度。
[0149]
表7:宏大芽孢杆菌dsm 33296和宏大芽孢杆菌dsm 33299细胞的pufa氧合产品的细胞外浓度。
[0150][0151]
实行例8:包括epa

dha氨基酸盐和宏大芽孢杆菌菌株的胶囊动作食物补充剂大概动作药物
[0152]
将以下组分弥补入hpmc胶囊(00尺寸)中。
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